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PCR反应中的强大新技术:让基因分析变得更快更便宜

本文作者:张利 2017-01-19 18:28
导语:在传统的PCR反应中,科学家应该何时由“高温变性”切换成“低温退火”步骤呢?他们很迷茫……

雷锋网AIHealth栏目按:DNA在高温时可以发生变性解链,当温度降低后又可以复性成为双链。因此,通过温度变化控制DNA的变性和复性,加入设计引物,DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制,此即为PCR体外扩增DNA的原理。

范德堡大学的研究人员开发了一种PCR反应中扩增DNA链的新方法,据称这种技术可以让基因分析变得更快更便宜,研究人员称之为适应性PCR技术(adaptive PCR ),该技术的核心是通过左旋DNA调节和监控PCR反应过程。

左旋DNA

正常DNA是右旋双螺旋结构,上世纪70年代,科学家发现了左旋DNA,左旋DNA的基因序列是正常DNA的镜像。

PCR反应中的强大新技术:让基因分析变得更快更便宜

如上图所示:A/B构象是右旋,Z构象是左旋

虽然左旋DNA与正常DNA的基因完全相同,但是其大多处于分子状态,所以可以用荧光标记物对左旋DNA进行标记,在PCR样本中加入少量有荧光标记的左旋DNA,与正常DNA进行相同的复制过程,就可以跟踪反应。

传统PCR的反应与科学家的“迷茫”

要理解适应性PCR的反应过程,首先我们来复习一下传统PCR扩增过程。

PCR由三个不同温度的反应阶段构成:

  • 高温变性:模板DNA解离,成为单链。

  • 低温退火:模板与引物结合。

  • 适温延伸:合成新的DNA链。

PCR反应中的强大新技术:让基因分析变得更快更便宜

这三种阶段的划分是通过人为控制反应温度实现的。通过改变反应温度,实现双链DNA变成单链、引物退火、引物沿着单链模板延伸为双链DNA三个关键步骤。在PCR反应过程中,最关键的就是控制样本的温度,但通常也是困难。

关键是科学家不知道他们应该何时改变反应温度?他们很迷茫。

通行的做法是:人为估计反应所需时间,而不是根据某一个特定反应步骤的结束来确定的。

适应性PCR的突破

在适应性PCR过程中,被荧光标记的左旋DNA分子与样本DNA进行相同的反应过程,就可以根据左旋DNA分子荧光的变化确定反应终点。

根据荧光的增强和减弱,研究人员就能知道某一特定的反应步骤是否完成了,以指导他们切换反应温度以进入下一个反应过程。

适应性PCR可以在分子水平监控反应,自动控制DNA的扩增。在这个过程中,在样本中加入少量左旋DNA,左旋DNA(L-DNA)显示为蓝色,模板DNA(D-DNA)即正常DNA显示为绿色,左旋DNA游离状态的引物荧光显示为红色,而游离的DNA单链荧光显示为黄色。

以下是不同反应阶段及其显示颜色:

  • 变性阶段(denaturation stage):加热样本,DNA解离成单链,左旋DNA上的红色和黄色荧光亮起。

  • 退火阶段(annealing stage):PCR反应中,左旋DNA样本与左旋DNA结合,红色荧光熄灭。

  • 延伸阶段(elongation stage):在DNA聚合酶的参与下,模板DNA合成新链,同时左旋DNA没有新链合成,但通过反应中红色荧光亮起可以判断,进入了下一轮的变性阶段。

下图即是适应性PCR的过程图解:

PCR反应中的强大新技术:让基因分析变得更快更便宜

每次循环,模板DNA的量翻一番,40次循环能产生超过一万亿个DNA拷贝。

PCR扩增反应是一个不稳定的反应过程,可能受到样本不精确或环境条件的影响。而这种持续检测和引导反应的方法能使得基因分析变得更快更便宜,并且有望缩小反应仪器的尺寸。

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